Volgens de wensen van de stichters werd het bestuur over de kapel toevertrouwd aan de wijkbewoners van de Nieuwstraat, de huidige Peetersstraat, de Graanmarkt en een deel van de Wolvenstraat. Twee kapelmeesters werden belast met het financieel beheer, terwijl vier afgevaardigden van de betrokken straten de rekeningen controleerden. De wijkbewoners kregen het voorrecht om in de kapel begraven te worden. Dit was later ook het geval voor de leden van de Sint-Barbaragilde. De stichtingsdatum van de Sint-Barbaragilde of de Colveniersgilde, zoals ze ook genoemd werd, is niet gekend, maar hij situeerde zich tussen 1444 en 1457. De gilde gebruikte vuurwapens die toen een ruimere verspreiding kenden. Zij had als gebedshuis de enkele decennia eerder opgerichte Sint-Barbarakapel. Sint-Barbara was de patrones van de gevaarlijke beroepen en het hanteren van vuurwapens was in de 15de eeuw zeker niet zonder risico. De heilige is trouwens nu nog steeds de patrones van de artilleristen. Door allerlei vrome stichtingen en via nalatenschappen was het aantal erediensten in de kapel in 1481 al opgeklommen tot zes missen per week. Zij werden meestal opgedragen door priesters van de Sint-Sulpitiuskerk. Tijdens de bezetting van Diest door troepen van Willem van Oranje in 1580-1583 werd de kapel geplunderd en zwaar beschadigd. De wijkbewoners en de gildebroeders herstelden min of meer de schade en vanaf 1583 konden er opnieuw erediensten plaatsvinden.
In het begin van de 17de eeuw  ging het niet goed met de werking van het stedelijk middelbaar onderwijs. Om dit te verbeteren werden de paters augustijnen aangetrokken om voortaan het stadscollege te leiden. Ook prins Filips Willem van Oranje-Nassau steunde dit initiatief. In het voorjaar van 1614 aanvaardde de stad de voorwaarden waarop de augustijnen zich te Diest zouden vestigen. De paters kochten het huis De Vier Gekroonden in de Overstraat als verblijf en kregen van de stad de beschikking over de Sint-Barbarakapel voor hun erediensten en over het Bushuis als schoolgebouw. Op 31 oktober 1614 gaf de abt van Tongerlo als begever van de Diestse parochies, de augustijnen de toelating om mis te vieren in de Sint-Barbarakapel. De wijkbewoners, die tot dan toe het bestuur over de kapel waarnamen, hadden ondertussen een aantal garanties gekregen over de voordelen, die zij eerder bij begrafenissen hadden. Tegelijk kregen ook de leden van de Sint-Barbaragilde altijd vrije toegang tot de kapel.
De nieuwe vestiging van de augustijnen kende snel succes bij de bevolking en na een tweetal jaren wilden de paters hun klooster en school al uitbreiden. De Sint-Barbarakapel bleek te klein te zijn voor haar nieuwe functie als kloosterkerk en als bidplaats voor de scholieren van de Latijnse school. Bovendien was het bouwwerk in slechte staat. In maart 1617 vroegen de paters aan prins Filips Willem steun voor de uitbouw van hun klooster met onder andere een nieuwe en grotere kerk. De prins gaf zijn toestemming en beloofde steun, maar door zijn plotse dood in februari 1618 kwam hiervan voorlopig niets in huis.

Vanaf 1644 drongen de augustijnen opnieuw aan voor de bouw van een nieuwe kerk. Omdat het terrein van de bestaande Sint-Barbarakapel te smal was, werd aan de stad en aan de heer van Diest gevraagd om de Kattestraat een aantal meters in de richting van de Graanmarkt op te schuiven. Het project werd op 31 mei 1644 door het stadsbestuur toegestaan en in 1653 door de heer van Diest bekrachtigd. Na de bouw van de kerk werd de huidige Kattestraat aangelegd. Op 26 juni 1656 werd uiteindelijk de eerste steen van de nieuwe Sint-Barbarakerk gelegd. De bouw werd mede mogelijk gemaakt dankzij giften van de inwoners en weldoeners en met de financiële steun van het stadsbestuur. Ook werd aan de paters het recht toegekend om een steenoven buiten de stadswallen op te richten. Hier werd een groot deel van de benodigde bakstenen vervaardigd.

De Sint-Barbarakerk werd in barokstijl gebouwd. Ze heeft de vorm van een zaalkerk die 12 meter breed en 41 meter lang is. Het geheel, bestaande uit vier traveeën met telkens grote, halfronde vensters, wordt op een hoogte van 22 meter door een tongewelf overspannen. Het koor is vrij ondiep en het transept is nauwelijks zichtbaar. Mogelijk was het ontwerp van de hand van de toenmalige prior Daniël Brassery, maar hierover bestaat geen archiefbron. Naast overste van het klooster was hij ook een bekwaam bouwmeester.

Tussen 1664 en 1667 kwamen dak en toren tot stand en omstreeks 1670 werd de zoldering in stukwerk voltooid. Het volgend jaar werd de eerste steen van de marmeren vloer gelegd. In 1673 werd begonnen met het plaatsen van de glasramen, meestal giften van verschillende Diestse families. Zo hadden Hugo de Croesere, drossaard van Diest, Jan-Baptist van den Berghen, deken van het Sint-Janskapittel, en de families Van Zurpele en Van Baussele elk hun glasraam. De paters oratorianen van Scherpenheuvel lieten ook een glasraam plaatsen met een afbeelding van Onze-Lieve-Vrouw en de wonderbare eik. Op 1 december 1673, de vooravond van het feest van de Heilige Barbara, werd de nieuwe kerk ingezegend door Servaes Vaes, de abt van Averbode en tevens grote weldoener van de kerk. Het zou echter nog tot het einde van de 18de eeuw duren voordat het meubilair en de binnenafwerking helemaal in orde was. Op 5 augustus 1725 werd de kerk plechtig geconsacreerd door kardinaal Thomas de Boussu, een gebeurtenis die herdacht werd door het opschrift in de poortboog der kerk: aUgilstl qillnta sanCtlflCata Deo Marlae barbaraeqile.

Architectonisch is de Sint-Barbarakerk zeer interessant omdat zij de enige in Diest is die in zuivere barokstijl gebouwd werd. Toch is het geen uitbundige barok geworden. Aan de buitenzijde is het gebouw erg sober omdat de augustijnen slechts beperkte financiële middelen hadden. De bouwmaterialen, baksteen en bruine ijzerzandsteen, doen trouwens niet rijkelijk aan. De voorgevel, gerestaureerd en lichtjes aangepast in 1896, zoals het Latijnse opschrift op de arduinen plaat aangeeft, vertoont twee wapenschilden: bovenaan dit van de augustijnen en op de arduinen plaat dit van de kruisheren. Rechts naast de ingangspoort, die men bereikt via een grote arduinen trap, gebouwd in 1845 ter vervanging van een vroegere halfronde trap, is een gedenksteen in de muur ingemetseld. Deze steen, afkomstig uit de catacomben van de Heilige Calixtus in Rome, werd op 29 augustus 1896 door paus Leo XIII aan de kerk geschonken. De sobere, 28 meter hoge voorgevel, wordt bekroond met een kruis, in de vorm van het wapen van de kruisheren. De zijgevels zijn nog soberder dan de voorgevel met als enige versiering het gebruik van ijzerzandsteenlagen tussen de baksteen. Het sierlijke klokkentorentje, dat centraal op de viering staat, is met iets meer fantasie dan de rest uitgewerkt. Het geheel van deze ranke toren, bestaande uit een afwisseling van rechthoekige, klokvormige en bolvormige elementen, bereikt een hoogte van 38 meter. Dit torentje is een typisch voorbeeld van de kunstzinnigheid en de vaardigheid van de 17de-eeuwse timmerlieden.
‍
Het interieur is versierd met een aantal architecturale ornamenten in stukwerk. Ook hier heeft het gebrek aan geld de ontwerper aan banden gelegd. Ondanks de sobere architectuur zijn er in het meubilair toch nog voorbeelden van een uitbundige barokstijl. In de eerste plaats is er het hoofdaltaar, versierd met prachtige beelden van de Heilige Maagd, de Heilige Augustinus en de Heilige Norbertus. Dit altaar werd in 1651 door de Antwerpse kunstenaar Pieter Verbruggen uitgevoerd. Het was door de abdij van Averbode besteld voor de nieuwe abdijkerk maar het bleek er niet te passen in het geheel van het interieur. In 1680 kocht Margareta van Baussele, de zuster van prior Jan van Baussele, het altaar voor 400 gulden en schonk het aan de augustijnen. Het schilderij dat te Averbode het altaar sierde en het werk was van Gaspar de Crayer, bleef in de abdij. Het werd in de augustijnenkerk vervangen door een schilderij van de Diestse kunstschilder Nicolaas Stramot I (1610-1682) met een voorstelling van de marteldood van de Heilige Barbara. Dit schilderij verdween echter spoorloos en werd in 1885 vervangen door een doek met hetzelfde onderwerp van de hand van de Diestenaar Frans Van Loo. Het hoofdaltaar werd in de 18de eeuw geflankeerd door twee kleinere zijaltaren. Het linkse is toegewijd aan Nicolaas van Toranino, een 13de-eeuwse augustijner heilige. Het rechtse altaar is toegewijd aan Maria, de moeder van Christus. Typisch voor de Sint-Barbarakerk is de prachtige eikenhouten wandbekleding waarin de preek- en biechtstoelen verwerkt zijn. Dit geheel werd versierd met zeer mooi beeldhouwwerk en met verschillende schilderijen, waarvan onder andere dit met de afbeelding van Samson en de leeuw, het werk was van Nicolaas Stramot II (1637-1709). Oorspronkelijk was het kerkgebouw voorzien voor het plaatsen van acht biechtstoelen, dit alleszins volgens het aantal nissen dat in de zijmuren uitgespaard werd. Of zij er allemaal ooit gestaan hebben, is niet duidelijk. Nu staan er nog vier, waarvan de achterste aan de zuidzijde het werk is van de Antwerpse beeldhouwer Jozef Vaseur (1789). Artistiek vertonen de vier biechtstoelen allemaal kenmerken die wijzen op de arbeid van verschillende kunstenaars. De preekstoel, het doksaal en het orgel dateren eveneens uit de tweede helft van de 18de eeuw.

De aanhechting van onze gewesten bij Frankrijk op het einde van de 18de eeuw had ingrijpende gevolgen voor de Diestse augustijnen. Op 2 december 1796 werden de paters op bevel van de Franse overheid uit hun klooster gezet en werd de Sint-Barbarakerk gesloten. Tussen 19 en 22 november 1796 was de inboedel al in beslag genomen. Het stadsbestuur wilde aanvankelijk de Sint-Barbarakerk gebruiken voor het vieren van de decadaire feesten en als de plaats waar de wetten van de republiek zouden worden afgekondigd. Het bestuur drong daarom bij de Nationale Domeinen aan om de kerk niet te verkopen. Dit plan werd echter nooit uitgevoerd en uiteindelijk werden de kerk en het klooster te koop gesteld. Het geheel werd gekocht door een zekere Delander, die echter niet in staat bleek om de koopsom te betalen. Uiteindelijk kwam er een tweede verkoop, waarna de kerk aangekocht werd door de Diestse advocaat Theodoor Di Martinelli. Deze laatste stelde de kerk opnieuw ter beschikking van de augustijnen en opende ze voor de eredienst, maar na zeer korte tijd werd ze  in 1798 opnieuw gesloten.

De kerk werd door de familie Di Martinelli gedurende decennia verhuurd als opslagplaats voor hout,  hooi, stro en andere materialen. Op een bepaald moment was ze zelfs het magazijn van een Diestse jeneverstoker. In december 1831 speelde een Belgische legerofficier in het kader van de inrichting van het Kamp van Diest met het plan om in de kerk de kanonnen en het materiaal van een eenheid veldartillerie op te slaan. Het stadsbestuur merkte echter op dat de kerk privébezit was en daarop week de artillerie uit naar de leegstaande Sint-Janskerk.



Op 5 augustus 1825 werd de kerk door de familie Di Martinelli ter gelegenheid van de 100ste verjaardag van de kerkwijding even voor het publiek geopend. Er vond wel geen gebedsdienst plaats.

In 1844 stonden het klooster en de kerk te koop. Dit trok de aandacht van de Nederlandse orde van de kruisheren in Uden. Aanvankelijk was niet iedereen in Diest gelukkig met de komst van deze nieuwe kloosterorde, maar met de instemming van de aartsbisschop van Mechelen zetten de paters door. Ondertussen was respectievelijk op 25 en 26 februari 1845 de officiële verkoop van de kloostergebouwen en van de kerk verleden voor notaris Verrijdt. Het klooster werd aangekocht van Theresia Maes en haar echtgenoot Nicolaas Rogge, beide renteniers, voor een bedrag van 17.000 frank. De kerk werd gekocht van notaris Di Martinelli voor 12.000 frank. Op 13 april 1845 deden de eerste drie kruisheren hun intrede te Diest. Voortaan was de Sint-Barbarakerk de nieuwe kloosterkapel van de kruisheren en dit voor ruim anderhalve eeuw.

De jarenlange verwaarlozing van de kerk had duidelijke sporen nagelaten zoals bleek uit een verslag van de kruisheren over het gebouw. De halfronde trap aan de ingang was haast onmogelijk om te betreden en de ingangsdeur had het uitzicht van een versleten staldeur. De meeste glazen in de ramen waren gebarsten of verdwenen. Het plafond en de muren waren erg vuil. Dit was ook het geval met de altaren, de communiebank en de biechtstoelen. Het dak van de kerk en de muren waren nog in een redelijke staat, maar de toren was bouwvallig.

De Kruisheren startten onmiddellijk met restauratiewerken. De huidige trap vooraan de kerk werd gebouwd, er kwam een nieuwe eikenhouten deur, het glas in de ramen werd vervangen en het interieur werd grondig gereinigd. Bij de herstelling van het orgel verongelukte jammer genoeg een arbeider door een val van de ladder. Naast het kerkgebouw maakten de kruisheren ook het oude augustijnenklooster bruikbaar voor hun nieuwe gemeenschap. Ook deze gebouwen hadden de voorbije decennia allerlei functies gehad en waren deels in erbarmelijke staat. Na intense arbeid werd op 26 mei 1845 de Sint-Barbarakerk plechtig heropend. De volgende jaren werden besteed aan het verder opsmukken van de kerk en het klooster.

In 1944 werd de Sint-Barbarakerk officieel erkend als monument. Vanaf het midden van de 20ste eeuw verminderde geleidelijk aan het aantal leden van de Diestse kruisheren. Ook het aantal kerkgangers daalde. De laatste kruisheren verlieten hun klooster en de laatste mis werd er opgedragen op zondag 15 juni 2015. Het complex kwam in handen van Sint-Annendaal-Grauwzusters, die het wilden integreren in de psychiatrische werking van hun instelling. Door gewijzigde inzichten en een veranderde subsidieregelgeving werd hiervan afgezien en veranderde de volledige kloostersite opnieuw van eigenaar. De nieuwe eigenaar gaf de Sint-Barbarakerk in beheer aan de in 2025 opgerichte vzw Vrienden van Sint-Barbara. Daarmee brak voor de kerk, ruim zes eeuwen na de stichting van de oorspronkelijke Sint-Barbarakapel, een nieuw hoofdstuk in haar geschiedenis aan.